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熒光定量服務(wù)


熒光定量PCR的基本原理就是在PCR擴增過程中，隨著PCR循環(huán)數(shù)的遞增，PCR產(chǎn)物不斷積累，熒光信號也會相應(yīng)的增加，這樣就可以通過熒光強度的變化來對PCR反應(yīng)進行實時的監(jiān)測，并以b-Actin或GAPDH等管架基因作為內(nèi)參照，對目的基因的表達量進行半定量檢測。

科佰生物將根據(jù)您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針法。通過對DNA或RNA的熒光定量PCR監(jiān)測, 實現(xiàn)基因的相對定量、定量和定性分析。

SYBR Green熒光染料法：適用于任何DNA，無需設(shè)計探針，采取雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，實驗周期短，結(jié)果重復(fù)性好，靈敏度高。

TaqMan熒光探針法：經(jīng)驗豐富的實驗技術(shù)人員設(shè)計探針，對目標(biāo)基因有高特異性，實驗重復(fù)性好，相對于SYBR Green法，靈敏度更高。

1.定量：

定量首先必須構(gòu)建與檢測樣品目的基因具有相同序列的標(biāo)準(zhǔn)品。使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作3個點以上的標(biāo)準(zhǔn)曲線后，可以使用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知濃度的檢測樣品進行量（起始拷貝數(shù)）分析。

2.相對定量（mRNA表達量分析）：

基因表達的研究一般采用相對定量的方法。相對定量法必須對樣品的目的基因和參比基因內(nèi)標(biāo)同時分別進行定量，然后求出對于參比基因的目的基因的相對量。通過對樣品間的目的基因的相對量進行比較，可以對不同樣品間的mRNA進行表達量分析。參比基因通常選用表達量相對恒定的House Keeping Gene，如：GAPDH、b-actin等。通過同時對參比基因的實時檢測，可以對樣品之間由于起始細(xì)胞數(shù)不同、或RNA提取效率的不同等造成的RNA量誤差進行校正，達到在嚴(yán)格意義上對樣品之間的mRNA表達量進行分析之目的。

1、總 RNA 提取及定量；

2、PCR 引物設(shè)計及反轉(zhuǎn)錄；

3、熒光引物設(shè)計（SYBR Green 熒光染料法）/探針設(shè)計（TaqMan 熒光探針法)；

4、熒光定量PCR，進行擴增曲線、溶解曲線、表達量差異分析等實驗；

5、數(shù)據(jù)分析與處理；

6、完整實驗報告。

樣品要求：

1.樣品可提供組織、細(xì)胞、RNA、cDNA中的一種,對于提供樣本的大致原則如下：組織樣本,盡可能提供2×2×2mm3體積或以上,新鮮組織可直接提供，不需處理；對于細(xì)胞樣本，盡可能提供3×10^6個細(xì)胞左右,加適量Trizol處理即可，確保樣品適于RNA抽提。RNA、cDNA含量根據(jù)同等細(xì)胞數(shù)量的細(xì)胞抽提和逆轉(zhuǎn)錄大致界定, 如果提供RNA或cDNA我們要對您提供的材料進行評估。

2.客戶提供盡可能詳細(xì)的背景信息；物種信息，擴增目的基因的NCBI登錄號等。

3.運輸要求，液氮或干冰保存寄送。

注：樣本應(yīng)避免各類污染和反復(fù)凍融。

提交的產(chǎn)品和資料：

1.RNA濃度及熒光定量PCR原始數(shù)據(jù)及分析結(jié)果；

2.熒光定量PCR完整的實驗步驟、使用儀器、軟件設(shè)置參數(shù)等。